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人胰島素原(PI)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明

發布時間:2023-11-15   點擊次數:140次

人胰島素原(PI)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明

PI簡介:

胰島素原(PI)是胰島素的前體激素,它是由由胰島β細胞合成和分泌,主要在腎臟分解代謝。生理情況下,只有極少量的胰島素原釋放入血,在病理情況下,胰島β細胞釋放胰島素原增多,血中胰島素原水平升高。它是細胞在裂解成成熟胰島素之前分泌的最后一個單鏈蛋白結構。它是由芝加哥大學的Donald F. Steiner教授在1967年發現的。

實驗原理:

試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被有人胰島素原(PI)捕獲抗體的微孔中,依次加入本、標準品、生物素標記的檢測抗體,HRP酶結合物,中間經過溫育洗滌,用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素原(PI)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。

試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

預包被96孔酶標板

Pre-coated Assay Plate

8×12

8×6

標準品

Standard

2

1

按說明書進行稀釋

通用稀釋液

Universal Diluent

2x20mL

1x20mL

濃縮生物素化檢100×

BiPIin-antibody (100×)

120μL

60μL

按說明書進行稀釋

濃縮酶結合物100×

Streptavidin-HRP (100×)

120μL

60μL

按說明書進行稀釋

2洗滌液

Wash Buffer (2)

2x10mL

1x10mL

按說明書進行稀釋

底物TMB

TMB Substrate

10mL

5mL

終止液

Stop Solution

6mL

3mL

封板膜

Plate Sealer

4

4

說明書

PItruction Manual

1

1

 

 

試劑盒參數:

性能


靈敏度

4.9 pg/mL

檢測范圍

12.5-800pg/mL

特異性

可檢測樣本中人的PI,且與其類似物無明顯交叉反應

 

需自備的設備及試劑: 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個標準品稀釋管.

樣本稀釋方案:

請提前預估樣本的濃度范圍 ,如果您的檢測樣本需要稀釋 ,參考稀釋方案如下:

稀釋 100 倍 :一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內 ,做 100 倍稀釋;

 

稀釋 1000 倍: 兩步稀釋 。 取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內 ,做 20 倍稀 釋 ,再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ,做 50 倍稀釋 ,總共稀釋 1000 倍;

 

稀釋 100000 倍 :三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內 ,做 40 倍 稀釋 ,再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ,做 50 倍稀釋 ,最后 取 5μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ,做 50 倍稀釋 ,總共稀釋100000 倍;

 

每步稀釋時取液量不少于 3μL ,稀釋倍數不超過 100 倍。每步稀釋都需混合均勻 ,避免起泡。

 

 

 

 

 

 

樣本處理及要求:

1. 血清:將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20分鐘,取上清即可,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

2. 血漿:EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

3. 組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

4. 細胞培養物上清:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

5. 其它生物標本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測。

6. 樣品外觀:樣品應清澈透明,懸浮物應離心去除。

7. 樣品保存:樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內檢測),或-80℃(6個月內檢測),避免反復凍融,標本溶血會影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

 

檢測前準備工作

1. 10分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。

標準品梯度工作液配制:加入1mL通用稀釋液至凍干標準品,靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為800pg/mL),然后按照以下濃度:800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、 100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、0pg/mL進行稀釋。

比稀釋方法:取7支 EP管,每管中加入500μL通用稀釋液,200pg/mL的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成100pg/mL的標準品工作液,按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔,不需要再從倒數第二管中吸取液體,具體如下圖。


1. 生物素化檢抗工作液配制:使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘,以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例:10μL濃縮液+990μL通用稀釋液),當日使用。

2. 酶結合物工作液配制:使用前15分鐘將100x濃縮酶結合物于1000×g離心1分鐘,以通用稀釋液將100×濃縮HRP酶結合物稀釋成1×工作濃度(例:10μL濃縮液+990μL通用稀釋液),當日使用。

3. 1×洗滌液配制10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中(從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正?,F象,放置室溫,輕搖均勻,待結晶溶解后再配置)。

操作步驟:

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。


2. 加樣分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl孔加入相應孔中,空白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。建議待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減少基質效應對測試結果的誤差影響,最后計算樣本濃度時乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔)。

 

 

3. 加生物素化抗體取出酶標板,棄去液體,不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μL,蓋上封板膜后37℃溫育1小時。

 

 

4. 洗板:棄去液體,每孔300μL 1x洗滌液,靜置1分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板3次(也可用洗板機洗板)。

 

 

5. 酶結合物工作液每孔加入酶結合物工作液100μL,蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。

 

 

6. 洗板棄去液體按步驟4洗滌方法,5次。

 

 

7. 加底物每孔加入底物(TMB)90μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育15分鐘。

 

8.  加終止液取出酶標板,每孔直接加入終止液50μL,立即在450nm波長處測定各孔的OD值。

 


結果判斷

1. 計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

典型數據和參考曲線

以下數據和曲線僅供參考,實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

濃度(pg/mL)

800

400

200

100

50

25

12.5

0

OD

2.32

1.93

1.31

0.85

0.51

0.39

0.28

0.1

校正OD

2.22

1.83

1.21

0.75

0.41

0.29

0.18

-

 



試劑盒性能:

1. 重復性:板內變異系數小于10%,板間變異系數小于10%。

2. 回收率:在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入3個不同濃度水平的人PI,計算回收率

樣本類型

范圍

平均回收率

血清(n=8)

84-101

96

血漿(n=8)

92-105

102

細胞培養上清(n=8)

96-108

105

 

 

 

 

 

 

3. 線性稀釋:分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人PI,在標準曲線動力學范圍內進行稀釋,評估線性。評估線性。

稀釋比例

回收率(%

血清

血漿

細胞培養上清

12

范圍(%

84-95

88-96

90- 110

平均回收率(%

91

93

96

14

范圍(%

89-103

87-108

105- 115

平均回收率(%

94

98

109

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


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